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龍圖騰網恭喜廣州醫科大學附屬第一醫院(廣州呼吸中心)申請的專利蛇毒致急性肺損傷小鼠肺部免疫細胞圖譜特征的建立方法獲國家發明授權專利權，本發明授權專利權由國家知識產權局授予，授權公告號為：CN115032374B 。

龍圖騰網通過國家知識產權局官網在2025-05-27發布的發明授權授權公告中獲悉：該發明授權的專利申請號/專利號為：202111420777.X，技術領域涉及：G01N33/50；該發明授權蛇毒致急性肺損傷小鼠肺部免疫細胞圖譜特征的建立方法是由黃君庭;梁子敬;周紅甜;張志文設計研發完成，并于2021-11-26向國家知識產權局提交的專利申請。

本蛇毒致急性肺損傷小鼠肺部免疫細胞圖譜特征的建立方法在說明書摘要公布了：本發明提供了蛇毒致急性肺損傷小鼠肺部免疫細胞圖譜特征的建立方法，包括以下步驟：S1提取免疫細胞；S2偶聯；S3染色；S4生信分析；本發明的有益效果：肺部組織均勻剪碎進行解離，根據細胞密度進行離心，分離得到大量的免疫細胞，采用高糖培養基進行洗滌，最大程度保證了肺部免疫細胞的得率和活性；通過臺盼藍染色可得知所得細胞的活率，基本大于90％；能夠對小鼠肺部免疫細胞同時進行42個抗體檢測，對細胞特異性標志和功能蛋白進行檢測，能觀察到肺部細胞亞群的動態變化。

本發明授權蛇毒致急性肺損傷小鼠肺部免疫細胞圖譜特征的建立方法在權利要求書中公布了：1.蛇毒致急性肺損傷小鼠肺部免疫細胞圖譜特征的建立方法，其特征在于：包括以下步驟：S1提取免疫細胞取因腹腔注射圓斑蝰蛇蛇毒所致急性肺損傷的小鼠，6h處死，心臟灌注，灌流出肺組織內部血液后摘取肺臟；將肺臟剪碎后與解離液混勻，在水浴箱中消化30min，再進行密度梯度離心和紅細胞裂解，得到純凈的小鼠肺部免疫細胞；S2偶聯使用抗體偶聯試劑盒，將金屬同位素與小鼠肺部免疫細胞標志物抗體連接，得到金屬標記的抗體；S3染色將分離得到的小鼠肺部免疫細胞與金屬標記的抗體進行孵育，標記免疫細胞；S4生信分析將標記后的小鼠肺部免疫細胞在質譜流式上機分析，采用t-SNE和phenograph算法對所得數據進行降維和聚類；然后將不同細胞亞群的多個檢測抗體的表達分布顯示在同一張熱圖上，并通過t-SNE圖展現不同標志物的表達在不同細胞亞群的表達量以及細胞亞群在細胞總數所占的比例，以此表現小鼠肺部免疫細胞的分類和功能觀察；所述金屬同位素采用cd金屬同位素，所述抗體偶聯試劑盒采用MaxparMCP9試劑盒，所述S2包括以下步驟：2.1取管子加入87ul、L-Buffer重懸polymer，并加入13ul、50mM、Cd元素溶液，37℃水浴60min，將其轉移至裝有100ul、L-Buffer的3kD柱子中，再向polymer管加入100ul、L-Buffer清洗管壁，然后轉移至3kDa濾柱中，充分混勻，室溫以相對離心力12000g離心處理25分鐘，棄上清，加入300ul、L-Buffer，室溫以相對離心力12000g離心處理30分鐘，加入400ul、C-Buffer，常溫以相對離心力12000g離心處理45分鐘；2.2取50kDa柱子加入100ug抗體，用R-Buffer將體積補足至400ul，室溫以相對離心力12000g離心處理10分鐘，棄廢液，加入400ul、R-Buffer，室溫以相對離心力12000g離心處理10分鐘，重復本操作一次；2.3用R-buffer稀釋TCEP至終濃度4mM，取100ul加入含有抗體的50kDa柱子，37℃水浴30min；2.4往3kD柱子中加入400ul、C-Buffer，室溫以相對離心力12000g離心處理30分鐘；2.5水浴結束后取50kDa柱子，往濾柱中加入300ul、C-Buffer，室溫以相對離心力12000g離心處理10分鐘，棄廢液，重復本操作一次；2.6用60ul、C-Buffer重懸3kDa濾芯中金屬和polymer的連接體，體轉移至裝有還原抗體的50kDa濾芯中，總體積約100ul，輕柔吹打混勻，37℃水浴90min；2.7水浴結束后，取出50kDa濾柱，向濾芯中加入200ul、W-Buffer，混勻，轉移至新標記的100kDa濾芯中，常溫以相對離心力5000g離心處理10分鐘；2.8加入400ul、W-Buffer，室溫以相對離心力5000g離心處理10分鐘，棄廢液，重復本操作三次；2.9向濾芯中加入75ul、W-Buffer，取2ul液體，在280nm下測定其光密度值，計算抗體濃度；2.10室溫以相對離心力12000g離心處理5分鐘，加入的抗體穩定液的體積，即獲得金屬標記好的抗體；或，所述金屬同位素采用鑭系金屬，所述抗體偶聯試劑盒采用MaxparX8試劑盒，所述S2包括以下步驟：2.1取管子加入95ul、L-Buffer重懸polymer，并加入5ul、50mM的鑭系金屬溶液混勻，37℃水浴30min，將其轉移至裝有200ul、L-Buffer的3kD柱子中，充分混勻，室溫以相對離心力12000g離心處理25分鐘，棄上清，重復本操作一次；2.2取50kDa柱子加入100ug抗體，用R-Buffer將體積補足至400ul，室溫以相對離心力12000g離心處理10分鐘；2.3用R-Buffer稀釋TCEP至終濃度4mM，取100ul加入含有抗體的50kDa柱子，37℃水浴30min；2.4往3kD柱子中加入400ul、C-Buffer，室溫以相對離心力12000g離心處理30分鐘；2.5水浴結束后取50kDa柱子，往濾柱中加入300ul、C-Buffer，室溫以相對離心力12000g離心處理10分鐘，棄廢液，重復本操作一次；2.6用60ul、C-Buffer重懸3kDa濾芯中金屬和polymer的連接體，體轉移至裝有還原抗體的50kDa濾芯中，總體積約100ul，輕柔吹打混勻，37℃水浴90min；2.7水浴結束后，取出50kDa濾柱，向濾芯中加入200ul、W-Buffer，室溫以相對離心力12000g離心處理10分鐘；2.8加入400ul、W-Buffer，室溫以相對離心力12000g離心處理10分鐘，棄廢液，重復本操作三次；2.9向濾芯中加入80ul、W-Buffer，取2ul液體，在280nm下測定其吸光值，計算抗體濃度；2.10室溫以相對離心力12000g離心處理10分鐘，加入的抗體穩定液的體積，即獲得金屬標記好的抗體。

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