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龍圖騰網恭喜深圳市小分子新藥創新中心有限公司申請的專利人工改造脫氨酶輔助的DNA中5-甲基胞嘧啶修飾單堿基分辨率定位分析方法獲國家發明授權專利權，本發明授權專利權由國家知識產權局授予，授權公告號為：CN115418391B 。

龍圖騰網通過國家知識產權局官網在2025-04-29發布的發明授權授權公告中獲悉：該發明授權的專利申請號/專利號為：202210955203.0，技術領域涉及：C12Q1/6806；該發明授權人工改造脫氨酶輔助的DNA中5-甲基胞嘧啶修飾單堿基分辨率定位分析方法是由袁必鋒;王敏;謝能彬設計研發完成，并于2022-08-10向國家知識產權局提交的專利申請。

本人工改造脫氨酶輔助的DNA中5-甲基胞嘧啶修飾單堿基分辨率定位分析方法在說明書摘要公布了：本發明公開了一種人工改造脫氨酶輔助的DNA中5?甲基胞嘧啶修飾單堿基分辨率定位分析方法。本發明利用人工改造的胞嘧啶脫氨酶eA3C?1蛋白對DNA中不同序列特征的胞嘧啶可以實現有效的脫氨基，而其對不同序列特征的5?甲基胞嘧啶不脫氨基的策略，隨后進行聚合酶鏈式反應擴增進而測序獲得5?甲基胞嘧啶的位點信息。該方法靈敏度高、選擇性高、操作簡便，不涉及亞硫酸氫鹽處理且無需其他生物酶介導，可以直接獲得DNA中5?甲基胞嘧啶的單堿基分辨率定位。

本發明授權人工改造脫氨酶輔助的DNA中5-甲基胞嘧啶修飾單堿基分辨率定位分析方法在權利要求書中公布了：1.一種用于非疾病診斷目的的人工改造脫氨酶輔助的DNA中5-甲基胞嘧啶修飾單堿基分辨率定位分析方法，其特征在于：包含如下步驟：S1：wtA3C和eA3C-1蛋白的表達及純化；所述wtA3C蛋白的氨基酸序列為NCBIGeneID:27350；所述eA3C-1蛋白的氨基酸序列與wtA3C相比僅有1處不同，即從188位親水氨基酸絲氨酸更改為疏水氨基酸異亮氨酸；S2：對待檢DNA進行變性及脫氨基處理：先對DNA進行變性處理使其形成單鏈，隨后用人工改造的脫氨酶eA3C-1對單鏈DNA進行脫氨基處理，再將反應體系中的脫氨基酶進行高溫滅活處理，具體步驟為：S2.1DNA變性處理是將DNA在95℃高溫下孵育10分鐘后立即轉入冰浴5分鐘使雙鏈DNA變性成單鏈DNA；S2.2所使用的脫氨基反應緩沖液中各成分的終濃度為20mM的4-羥乙基哌嗪乙磺酸，pH為5.5；S2.3脫氨基蛋白的用量需要根據實驗過程中表達的脫氨酶蛋白的具體活性進行調整，以保證脫氨基蛋白的用量可以使反應體系中DNA上的胞嘧啶充分脫氨基；脫氨基反應溫度為37℃，反應時間為4小時；S2.4脫氨酶的高溫滅活處理是在脫氨基反應結束后對反應體系進行90℃，10分鐘的孵育，待反應溫度冷卻至室溫可進行下一步操作；S3：擴增脫氨后的DNA片段：取上述40ng脫氨基樣品進行聚合酶鏈式反應，對脫氨基的DNA片段進行擴增；S4：特定序列的DNA片段，經擴增后可以直接進行Sanger測序；經eA3C-1處理的待檢DNA中的不同基序的C位點在測序中被讀為T，而5mC位點在測序中被讀為C。

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