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龍圖騰網(wǎng)恭喜江南大學(xué)申請的專利一種惡臭假單胞菌中4-異丙基苯甲酸誘導(dǎo)的高強(qiáng)度表達(dá)體系的構(gòu)建方法獲國家發(fā)明授權(quán)專利權(quán)，本發(fā)明授權(quán)專利權(quán)由國家知識產(chǎn)權(quán)局授予，授權(quán)公告號為：CN117165618B 。

龍圖騰網(wǎng)通過國家知識產(chǎn)權(quán)局官網(wǎng)在2025-04-01發(fā)布的發(fā)明授權(quán)授權(quán)公告中獲悉：該發(fā)明授權(quán)的專利申請?zhí)?專利號為：202310472681.0，技術(shù)領(lǐng)域涉及：C12N15/78；該發(fā)明授權(quán)一種惡臭假單胞菌中4-異丙基苯甲酸誘導(dǎo)的高強(qiáng)度表達(dá)體系的構(gòu)建方法是由劉春立;底心怡;白仲虎;劉秀霞;楊艷坤設(shè)計研發(fā)完成，并于2023-04-27向國家知識產(chǎn)權(quán)局提交的專利申請。

本一種惡臭假單胞菌中4-異丙基苯甲酸誘導(dǎo)的高強(qiáng)度表達(dá)體系的構(gòu)建方法在說明書摘要公布了：本發(fā)明公開了一種惡臭假單胞菌中4?異丙基苯甲酸誘導(dǎo)的高強(qiáng)度表達(dá)體系的構(gòu)建方法，以惡臭假單胞菌F1PseudomonasPutidaF1代謝途徑中存在的4?異丙基苯甲酸cumate誘導(dǎo)的cym操縱子為基礎(chǔ)，替換其原有表達(dá)用啟動子以及表達(dá)目的基因，通過組合多阻遏位點(diǎn)，得到改造后的cym操縱子，從而使得熒光蛋白表達(dá)強(qiáng)度提高；本發(fā)明確定了所述誘導(dǎo)系統(tǒng)的誘導(dǎo)劑在惡臭假單胞菌中的有效響應(yīng)范圍，同時篩選得到響應(yīng)最好的多阻遏位點(diǎn)誘導(dǎo)系統(tǒng)。

本發(fā)明授權(quán)一種惡臭假單胞菌中4-異丙基苯甲酸誘導(dǎo)的高強(qiáng)度表達(dá)體系的構(gòu)建方法在權(quán)利要求書中公布了：1.一種惡臭假單胞菌中4-異丙基苯甲酸誘導(dǎo)的高強(qiáng)度表達(dá)體系的構(gòu)建方法，其特征在于：包括，以惡臭假單胞菌F1（PseudomonasPutidaF1）代謝途徑中存在的4-異丙基苯甲酸誘導(dǎo)的cym操縱子為基礎(chǔ)替換其原有表達(dá)用啟動子以及表達(dá)目的基因，通過組合阻遏位點(diǎn)，構(gòu)建得到改造后的cym操縱子；所述替換其原有表達(dá)用啟動子以及表達(dá)目的基因，包括,以質(zhì)粒pBBR1-pTrc為模板，設(shè)計引物1、引物2通過PCR擴(kuò)增抗性基因Kan、復(fù)制子pBBR1oriV、pBBR1Rep得到片段1；以惡臭假單胞菌F1純化基因組為模板，設(shè)計引物3、引物4通過PCR擴(kuò)增阻遏蛋白基因cymR得到片段2；設(shè)計引物5、引物6通過PCR擴(kuò)增cym操縱子阻遏位點(diǎn)CuO1和啟動子得到片段3；設(shè)計引物7、引物8通過PCR擴(kuò)增綠色熒光蛋白基因eGFP得到片段4；片段1、片段3和片段4進(jìn)行Gibson組裝，培養(yǎng)提取得到pBBR1-lacI-CuO1-eGFP質(zhì)粒；以質(zhì)粒pBBR1-lacI-CuO1-eGFP為模板，設(shè)計引物9、引物10通過PCR擴(kuò)增除lacI基因部分得到片段5；片段5進(jìn)行Gibson組裝，培養(yǎng)提取得到pBBR1-CuO1-eGFP質(zhì)粒，核苷酸序列如SEQIDNO:13所示；以質(zhì)粒pBBR1-CuO1-eGFP為模板，通過酶切位點(diǎn)XbaI和HindIII對質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切，產(chǎn)物通過膠回收得到線性化載體片段6；片段2和片段6進(jìn)行Gibson組裝，培養(yǎng)提取得到pBBR1-cymR-CuO1-eGFP質(zhì)粒，核苷酸序列如SEQIDNO:14所示；以pBBR1-CuO1-eGFP和pBBR1-cymR-CuO1-eGFP質(zhì)粒為模板，設(shè)計引物11、12通過PCR擴(kuò)增兩個質(zhì)粒載體得到片段7和片段8；片段7、片段8分別進(jìn)行Gibson組裝即得到pBBR1-Ptac-CuO1-eGFP和pBBR1-cymR-Ptac-CuO1-eGFP質(zhì)粒，所述改造后的操縱子質(zhì)粒包含pBBR1-cymR-Ptac-CuO1-eGFP質(zhì)粒；其中，所述引物1為pBBR1vector-F，核苷酸序列如SEQIDNO:1所示；引物2為pBBR1vector-R，核苷酸序列如SEQIDNO:2所示；引物3為cymR-F，核苷酸序列如SEQIDNO:3所示；引物4為cymR-R，核苷酸序列如SEQIDNO:4所示；引物5為CuO1-F，核苷酸序列如SEQIDNO:5所示；引物6為CuO1-R，核苷酸序列如SEQIDNO:6所示；引物7為eGFP-F，核苷酸序列如SEQIDNO:7所示；引物8為eGFP-R，核苷酸序列如SEQIDNO:8所示；引物9為dlacI-F，核苷酸序列如SEQIDNO:9所示；引物10為dlacI-R，核苷酸序列如SEQIDNO:10所示；引物11為tac-F，核苷酸序列如SEQIDNO:11所示；引物12為tac-R，核苷酸序列如SEQIDNO:12所示；其中，所述改造后的cym操縱子包括編碼阻遏蛋白基因cymR、阻遏位點(diǎn)CuO1、外源引入的啟動子tac、綠色熒光蛋白eGFP；其中，所述4-異丙基苯甲酸誘導(dǎo)的cym操縱子序列中的阻遏位點(diǎn)CuO1如SEQIDNO:23所示；將改造后的cym操縱子質(zhì)粒轉(zhuǎn)入惡臭假單胞菌KT2440中，作為惡臭假單胞菌中4-異丙基苯甲酸誘導(dǎo)的高強(qiáng)度表達(dá)體系；該表達(dá)體系于惡臭假單胞菌中能夠在4-異丙基苯甲酸的添加下有效響應(yīng)，所述4-異丙基苯甲酸誘導(dǎo)濃度為50~800mgL，所述改造后的cym操縱子在400mgL4-異丙基苯甲酸誘導(dǎo)劑濃度下達(dá)到最高熒光蛋白表達(dá)響應(yīng)強(qiáng)度。

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