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龍圖騰網獲悉江南大學申請的專利一種惡臭假單胞菌中4-異丙基苯甲酸誘導的高強度表達體系的構建方法獲國家發(fā)明授權專利權，本發(fā)明授權專利權由國家知識產權局授予，授權公告號為：CN117165618B 。

龍圖騰網通過國家知識產權局官網在2025-04-01發(fā)布的發(fā)明授權授權公告中獲悉：該發(fā)明授權的專利申請?zhí)?專利號為：202310472681.0，技術領域涉及：C12N15/78；該發(fā)明授權一種惡臭假單胞菌中4-異丙基苯甲酸誘導的高強度表達體系的構建方法是由劉春立;底心怡;白仲虎;劉秀霞;楊艷坤設計研發(fā)完成，并于2023-04-27向國家知識產權局提交的專利申請。

本一種惡臭假單胞菌中4-異丙基苯甲酸誘導的高強度表達體系的構建方法在說明書摘要公布了：本發(fā)明公開了一種惡臭假單胞菌中4?異丙基苯甲酸誘導的高強度表達體系的構建方法，以惡臭假單胞菌F1PseudomonasPutidaF1代謝途徑中存在的4?異丙基苯甲酸cumate誘導的cym操縱子為基礎，替換其原有表達用啟動子以及表達目的基因，通過組合多阻遏位點，得到改造后的cym操縱子，從而使得熒光蛋白表達強度提高；本發(fā)明確定了所述誘導系統(tǒng)的誘導劑在惡臭假單胞菌中的有效響應范圍，同時篩選得到響應最好的多阻遏位點誘導系統(tǒng)。

本發(fā)明授權一種惡臭假單胞菌中4-異丙基苯甲酸誘導的高強度表達體系的構建方法在權利要求書中公布了：1.一種惡臭假單胞菌中4-異丙基苯甲酸誘導的高強度表達體系的構建方法，其特征在于：包括，以惡臭假單胞菌F1（PseudomonasPutidaF1）代謝途徑中存在的4-異丙基苯甲酸誘導的cym操縱子為基礎替換其原有表達用啟動子以及表達目的基因，通過組合阻遏位點，構建得到改造后的cym操縱子；所述替換其原有表達用啟動子以及表達目的基因，包括,以質粒pBBR1-pTrc為模板，設計引物1、引物2通過PCR擴增抗性基因Kan、復制子pBBR1oriV、pBBR1Rep得到片段1；以惡臭假單胞菌F1純化基因組為模板，設計引物3、引物4通過PCR擴增阻遏蛋白基因cymR得到片段2；設計引物5、引物6通過PCR擴增cym操縱子阻遏位點CuO1和啟動子得到片段3；設計引物7、引物8通過PCR擴增綠色熒光蛋白基因eGFP得到片段4；片段1、片段3和片段4進行Gibson組裝，培養(yǎng)提取得到pBBR1-lacI-CuO1-eGFP質粒；以質粒pBBR1-lacI-CuO1-eGFP為模板，設計引物9、引物10通過PCR擴增除lacI基因部分得到片段5；片段5進行Gibson組裝，培養(yǎng)提取得到pBBR1-CuO1-eGFP質粒，核苷酸序列如SEQIDNO:13所示；以質粒pBBR1-CuO1-eGFP為模板，通過酶切位點XbaI和HindIII對質粒進行雙酶切，產物通過膠回收得到線性化載體片段6；片段2和片段6進行Gibson組裝，培養(yǎng)提取得到pBBR1-cymR-CuO1-eGFP質粒，核苷酸序列如SEQIDNO:14所示；以pBBR1-CuO1-eGFP和pBBR1-cymR-CuO1-eGFP質粒為模板，設計引物11、12通過PCR擴增兩個質粒載體得到片段7和片段8；片段7、片段8分別進行Gibson組裝即得到pBBR1-Ptac-CuO1-eGFP和pBBR1-cymR-Ptac-CuO1-eGFP質粒，所述改造后的操縱子質粒包含pBBR1-cymR-Ptac-CuO1-eGFP質粒；其中，所述引物1為pBBR1vector-F，核苷酸序列如SEQIDNO:1所示；引物2為pBBR1vector-R，核苷酸序列如SEQIDNO:2所示；引物3為cymR-F，核苷酸序列如SEQIDNO:3所示；引物4為cymR-R，核苷酸序列如SEQIDNO:4所示；引物5為CuO1-F，核苷酸序列如SEQIDNO:5所示；引物6為CuO1-R，核苷酸序列如SEQIDNO:6所示；引物7為eGFP-F，核苷酸序列如SEQIDNO:7所示；引物8為eGFP-R，核苷酸序列如SEQIDNO:8所示；引物9為dlacI-F，核苷酸序列如SEQIDNO:9所示；引物10為dlacI-R，核苷酸序列如SEQIDNO:10所示；引物11為tac-F，核苷酸序列如SEQIDNO:11所示；引物12為tac-R，核苷酸序列如SEQIDNO:12所示；其中，所述改造后的cym操縱子包括編碼阻遏蛋白基因cymR、阻遏位點CuO1、外源引入的啟動子tac、綠色熒光蛋白eGFP；其中，所述4-異丙基苯甲酸誘導的cym操縱子序列中的阻遏位點CuO1如SEQIDNO:23所示；將改造后的cym操縱子質粒轉入惡臭假單胞菌KT2440中，作為惡臭假單胞菌中4-異丙基苯甲酸誘導的高強度表達體系；該表達體系于惡臭假單胞菌中能夠在4-異丙基苯甲酸的添加下有效響應，所述4-異丙基苯甲酸誘導濃度為50~800mgL，所述改造后的cym操縱子在400mgL4-異丙基苯甲酸誘導劑濃度下達到最高熒光蛋白表達響應強度。

如需購買、轉讓、實施、許可或投資類似專利技術，可聯系本專利的申請人或專利權人江南大學，其通訊地址為：214000 江蘇省無錫市梁溪區(qū)通沙路898號南樓七層；或者聯系龍圖騰網官方客服，聯系龍圖騰網可撥打電話0551-65771310或微信搜索“龍圖騰網”。