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龍圖騰網(wǎng)恭喜華南師范大學(xué)申請(qǐng)的專利一種利用Tth Ago酶剪切檢測(cè)基因單堿基突變的方法及其應(yīng)用獲國(guó)家發(fā)明授權(quán)專利權(quán)，本發(fā)明授權(quán)專利權(quán)由國(guó)家知識(shí)產(chǎn)權(quán)局授予，授權(quán)公告號(hào)為：CN114921529B 。

龍圖騰網(wǎng)通過(guò)國(guó)家知識(shí)產(chǎn)權(quán)局官網(wǎng)在2025-05-23發(fā)布的發(fā)明授權(quán)授權(quán)公告中獲悉：該發(fā)明授權(quán)的專利申請(qǐng)?zhí)?專利號(hào)為：202210527142.8，技術(shù)領(lǐng)域涉及：C12Q1/6851；該發(fā)明授權(quán)一種利用Tth Ago酶剪切檢測(cè)基因單堿基突變的方法及其應(yīng)用是由常好才;朱夢(mèng)媛;歐陽(yáng)雯雯設(shè)計(jì)研發(fā)完成，并于2022-05-16向國(guó)家知識(shí)產(chǎn)權(quán)局提交的專利申請(qǐng)。

本一種利用Tth Ago酶剪切檢測(cè)基因單堿基突變的方法及其應(yīng)用在說(shuō)明書摘要公布了：本發(fā)明公開一種利用TthAgo酶剪切檢測(cè)基因單堿基突變的方法及其應(yīng)用。該方法包括如下步驟：1根據(jù)需要檢測(cè)的目標(biāo)基因或DNA序列設(shè)計(jì)2條識(shí)別突變端的gDNA和2條識(shí)別非突變端的gDNA，均為16～19nt；2利用設(shè)計(jì)的4條gDNA和TthAgo酶對(duì)目標(biāo)基因或DNA片段進(jìn)行剪切；3針對(duì)目標(biāo)基因或DNA片段上TthAgo酶兩端剪切位點(diǎn)之間的45～65bp序列設(shè)計(jì)恒溫?cái)U(kuò)增的引物，并進(jìn)行PCR恒溫?cái)U(kuò)增；4根據(jù)恒溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)過(guò)程中待測(cè)樣品相對(duì)野生型樣品的Ct值來(lái)判斷待測(cè)樣品中是否存在單堿基突變。本發(fā)明方法步驟簡(jiǎn)便，操作簡(jiǎn)單，具有高特異性、高靈敏性，可用于低豐度單堿基突變的檢測(cè)。

本發(fā)明授權(quán)一種利用Tth Ago酶剪切檢測(cè)基因單堿基突變的方法及其應(yīng)用在權(quán)利要求書中公布了：1.一種非疾病診斷目的的利用TthAgo酶剪切檢測(cè)基因單堿基突變的方法，其特征在于，包括如下步驟：（1）設(shè)計(jì)4條gDNA根據(jù)目標(biāo)基因或DNA片段序列分別設(shè)計(jì)2條16～19nt的5’端第一個(gè)堿基均為T且被磷酸基團(tuán)修飾的識(shí)別突變端和識(shí)別非突變端的gDNA；其中，識(shí)別突變端的gDNA除第一個(gè)堿基外，其余序列與目標(biāo)基因的突變型基因序列互補(bǔ)，且與野生型目標(biāo)基因或DNA片段的錯(cuò)配位點(diǎn)位于互補(bǔ)序列的第9、10、11或15位；識(shí)別非突變端的gDNA除第一個(gè)堿基外，其余序列與突變端gDNA剪切位點(diǎn)的上游或下游45～65bp處的序列互補(bǔ)；4條gDNA序列不同；（2）TthAgo酶剪切將TthAgo酶、步驟（1）中的識(shí)別突變端和識(shí)別非突變端的gDNA分別在含1～6mmolLMn2+的緩沖體系中孵育15～30分鐘，然后將其混合并加入含目標(biāo)基因或DNA片段的待測(cè)樣品，在75℃~85℃下進(jìn)行剪切反應(yīng)，同時(shí)以含目標(biāo)基因或DNA片段的野生型基因?yàn)閷?duì)照樣品，反應(yīng)得到酶切產(chǎn)物；（3）熒光定量PCR①根據(jù)突變端和非突變端gDNA引導(dǎo)的TthAgo酶在目標(biāo)基因或DNA片段上的兩端剪切位點(diǎn)之間的45～65bpDNA片段序列設(shè)計(jì)一對(duì)長(zhǎng)度為20～25nt、且滿足從該DNA片段兩端的頂端開始擴(kuò)增的PCR恒溫?cái)U(kuò)增引物；②將步驟（2）中的酶切產(chǎn)物先經(jīng)核酸外切酶處理，然后分別加入到含有具有鏈置換活性的DNA聚合酶、體積百分比1～4%PEG200和0.9～1.8molL甜菜堿的反應(yīng)體系中，利用步驟①中的PCR恒溫?cái)U(kuò)增引物進(jìn)行擴(kuò)增，分別獲取實(shí)時(shí)熒光曲線，以此判斷待測(cè)樣品中是否存在單堿基突變；（4）判斷若對(duì)照樣品的實(shí)時(shí)熒光曲線隨著時(shí)間的變化一直趨于平穩(wěn)或其Ct值低于待測(cè)樣品的Ct值，且待測(cè)樣品的實(shí)時(shí)熒光曲線隨著時(shí)間的延長(zhǎng)存在指數(shù)擴(kuò)增的過(guò)程，說(shuō)明該待測(cè)樣品存在單堿基突變；若待測(cè)樣品的實(shí)時(shí)熒光曲線隨時(shí)間變化與對(duì)照樣品一致，說(shuō)明該待測(cè)樣品不存在單堿基突變。

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