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龍圖騰網(wǎng)恭喜華中農(nóng)業(yè)大學申請的專利利用單堿基編輯技術創(chuàng)造除草劑抗性植物的方法獲國家發(fā)明授權專利權，本發(fā)明授權專利權由國家知識產(chǎn)權局授予，授權公告號為：CN113215161B 。

龍圖騰網(wǎng)通過國家知識產(chǎn)權局官網(wǎng)在2025-04-01發(fā)布的發(fā)明授權授權公告中獲悉：該發(fā)明授權的專利申請?zhí)?專利號為：202110609717.6，技術領域涉及：C12N15/113；該發(fā)明授權利用單堿基編輯技術創(chuàng)造除草劑抗性植物的方法是由金雙俠;張獻龍;王茂軍;丁霄;惠鳳嬌設計研發(fā)完成，并于2021-06-01向國家知識產(chǎn)權局提交的專利申請。

本利用單堿基編輯技術創(chuàng)造除草劑抗性植物的方法在說明書摘要公布了：本發(fā)明涉及除草劑技術領域，且公開了利用單堿基編輯技術創(chuàng)造除草劑抗性植物的方法，包括以下步驟：1GhEPSP基因的sgRNA設計：選擇陸地棉5?烯醇式丙酮酰莽草酸?3?磷酸合酶5?Enolpyruvylshikimate?3?phosphatesynthase，EPSP合酶為驗證基因，利用在線軟件CRISPR?Phttp：cbi.hzau.edu.cncgi?binCRISPRLeietal2014在基因外顯子區(qū)域設計sgRNA靶標序列，并且在編輯窗口內C?T突變改變氨基酸功能的靶點，最終選擇1個sgRNA用來構建單堿基系統(tǒng)植物表達載體。該利用單堿基編輯技術創(chuàng)造除草劑抗性植物的方法，在棉花中首次成功應用棉花基因組特性的單堿基編輯系統(tǒng)對棉花GhEPSP實現(xiàn)單堿基突變，突變位點未見其他作物報道，通過葉片草甘膦涂抹實驗，表現(xiàn)出一定的草甘膦耐受性，提高了棉田除草效率，降低了人工除草成本，防范棉田超級雜草。

本發(fā)明授權利用單堿基編輯技術創(chuàng)造除草劑抗性植物的方法在權利要求書中公布了：1.利用單堿基編輯技術創(chuàng)造除草劑抗性棉花的方法，其特征在于，包括以下步驟：1GhEPSP基因的sgRNA設計：選擇陸地棉5-烯醇式丙酮酰莽草酸-3-磷酸合酶為驗證基因，利用在線軟件CRISPR-P在基因外顯子區(qū)域設計sgRNA靶標序列，并且在編輯窗口內C-T突變改變氨基酸功能的靶點，最終選擇1個sgRNA用來構建單堿基系統(tǒng)植物表達載體；2sgRNA與GhBE3載體的連接：靶標插入GhBE3載體序列為tRNA-sgRNA-gRNA的重復序列，需要中間載體轉換，第一次PCR的引物如下：pRGEB32-7S：AAGCATCAGATGGGCAAACAAAGCACCAGTGGTCTAG，將sgRNA加到反向引物的接頭上，GhEPSPAS：TTCCACCGGGAAGACCACCCTGCACCAGCCGGGAAT，下劃線的堿基是sgRNA序列，以PGTR載體為模板進行PCR擴增tRNA序列，獲得tRNA+sgRNA，利用一步克隆試劑盒將tRNA+sgRNA片段分別連接到pGREB32-GhU6-7載體的BsaI酶切位點處，利用HpaI和SbfI雙酶切pGREB32-GhU6-7，將目的片段連接到GhBE3載體的HpaI和SbfI雙酶切位點處；3農(nóng)桿菌介導的遺傳轉化：A、將剝好的棉花種子用0.1％升汞殺菌，無菌水清洗數(shù)次后放入無菌苗培養(yǎng)基中，28℃暗培養(yǎng)1天，挑去種皮，將苗扶正，在28℃，暗培養(yǎng)4d；B、將下胚軸切成小莖段，用活化后的農(nóng)桿菌侵染，棄菌液，并吹干；C、將下胚軸平鋪在放有濾紙的共培養(yǎng)培養(yǎng)基中，于20℃，暗培養(yǎng)1d；D、將下胚軸轉入到附加2,4-D的愈傷組織誘導培養(yǎng)基中，放入光照培養(yǎng)室，25d用新鮮愈傷組織誘導培養(yǎng)基繼代培養(yǎng)一次；E、當愈傷組織長成米粒狀顆粒，轉入分化培養(yǎng)基中，進一步分化成胚狀體；F、將分化出的小苗繼代到生根培養(yǎng)基中，直至長成生根健康的小苗；G、將小苗轉到清水中，進行煉苗，一周后，轉移到溫室；4測序檢測編輯：提取的棉花嫩葉陽性基因組DNA，以陽性DNA為模板，擴增GhEPSP基因，然后將PCR片段連入pGEM-Teasy載體，將連接產(chǎn)物熱激轉化大腸桿菌感受態(tài)TOP10，挑取的單克隆進行陽性檢測并進行Sanger測序，將測序結果與靶標序列比對；5葉片涂抹草甘膦：將農(nóng)達稀釋200倍，涂抹棉花葉片，一周后觀察葉片藥害情況。

如需購買、轉讓、實施、許可或投資類似專利技術，可聯(lián)系本專利的申請人或專利權人華中農(nóng)業(yè)大學，其通訊地址為：430070 湖北省武漢市洪山區(qū)獅子山街1號；或者聯(lián)系龍圖騰網(wǎng)官方客服，聯(lián)系龍圖騰網(wǎng)可撥打電話0551-65771310或微信搜索“龍圖騰網(wǎng)”。